猪肠类器官培养基试剂盒（JFKR-PNC-100-KIT/JFKR-PNC-500-KIT）

1. 产品概述

猪肠类器官培养基试剂盒（JFKR-PNC-100-KIT / JFKR-PNC-500-KIT）是一种专门为猪肠道类器官培养设计的培养基试剂盒。该试剂盒提供了从猪肠道组织中分离、培养和维持类器官所需的全套试剂和培养基，适用于肠道发育、疾病模型、药物筛选及再生医学等领域的研究。试剂盒包含基础培养基和添加因子，能够支持猪肠类器官的长期生长和功能维持。

2. 产品特点

• 高效分离与培养：试剂盒中的消化酶和培养基配方经过优化，能够高效分离猪肠道隐窝或干细胞，并支持类器官的快速形成和长期培养。

• 高存活率：添加的生长因子和营养物质能够显著提高类器官的存活率和增殖能力。

• 功能维持：培养基配方能够维持类器官的肠道特异性功能，如屏障功能、分泌功能和代谢活性。

• 标准化操作：试剂盒提供标准化的操作流程，减少实验变量，确保实验结果的可重复性。

• 多种规格：提供100 mL（JFKR-PNC-100-KIT）和500 mL（JFKR-PNC-500-KIT）两种规格，满足不同实验规模的需求。

3. 应用领域

• 肠道发育研究：用于研究猪肠道干细胞的自我更新和分化机制。

• 疾病模型构建：通过基因编辑或药物处理，构建猪肠类器官疾病模型，如炎症性肠病（IBD）、肠癌等。

• 药物筛选与毒性测试：利用猪肠类器官进行药物吸收、代谢和毒性测试，为新药开发提供支持。

• 再生医学研究：研究猪肠类器官在肠道损伤修复和再生中的应用潜力。

• 宿主-微生物相互作用：研究肠道微生物与宿主细胞的相互作用机制。

4. 使用方法

1. 组织分离：使用试剂盒中的消化酶从猪肠道组织中分离隐窝或干细胞。

2. 基质胶包埋：将分离的细胞与基质胶混合，接种于培养板中。

3. 培养基添加：加入配制好的完全培养基，定期更换培养基。

4. 类器官培养：在37°C、5% CO₂的培养箱中培养，定期观察类器官的生长状态。

5. 传代与冻存：根据实验需求，对类器官进行传代或冻存。

5. 注意事项

• 无菌操作：所有操作需在无菌条件下进行，避免污染。

• 基质胶处理：基质胶在低温下为液态，需在冰上操作，室温下会迅速凝固。

• 培养基更换：定期更换培养基，确保类器官获得充足的营养。

• 类器官鉴定：通过形态学观察和标志物染色（如Lgr5、Ki67等）鉴定类器官的质量和功能。

6. 研究案例

• 肠道干细胞研究：利用JFKR-PNC试剂盒培养猪肠类器官，研究肠道干细胞的自我更新和分化机制。

• 炎症性肠病模型：通过添加炎症因子（如TNF-α、IL-6）构建猪肠类器官炎症模型，用于药物筛选。

• 药物毒性测试：利用猪肠类器官评估药物的肠道毒性和吸收效率。

7. 总结

猪肠类器官培养基试剂盒（JFKR-PNC-100-KIT / JFKR-PNC-500-KIT）是一种高效、标准化的类器官培养工具，适用于猪肠道发育、疾病模型、药物筛选和再生医学等领域的研究。其优化的培养基配方和全面的试剂组成能够支持猪肠类器官的高效培养和功能维持，为肠道生物学研究提供了强有力的技术支持。

8.试剂盒产品信息

备注：基质胶仅试剂盒Pro版含有,以上所有成分都可单独购买。

9.试剂到货处理：

1. 猪肠类器官培养基A 在4 ℃可保存3个月，收到货后4 ℃保存，建议1个月内使用完毕，长期不用建议放于-20 ℃储存，避免反复冻融超过2次。

2.组织保存液E、专用原代组织消化液C内含有维持细胞活性营养成分，为了保持试剂营养成分的活性，长期不用建议放于-20 ℃储存，避免反复冻融超过2次。

10.详细操作步骤与方法：

1 组织前处理

1.1 实验材料

需提前准备原代缓冲液B（4 ℃预冷）、组织保存液E、取样管、组织运输箱、冰袋。

1.2 组织的获取与运输

组织的取样与运输是类器官构建成功的第一个环节也是最容易忽视的环节，若组织前期保存不当会导致细胞活性差、污染、正常细胞少等问题，降低类器官构建成功率。

组织应在离体的30 min内放入组织保存液E，原代缓冲液B清洗3-5次，将组织表面血液冲洗干净，放入组织保存液E中，取样管于4 ℃低温保存运输（72 h内）。

2 类器官原代培养（以24孔板为例）

2.1 实验材料

需提前准备原代缓冲液B（4 ℃）、专用原代组织消化液C（4℃）、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、 猪肠类器官培养基A（室温或37 ℃）、镊子（10㎝）、尖头眼科手术剪/手术刀片、一次性60 mm培养皿、1.5 mL/15 mL/50 mL离心管、100㎛细胞滤网、3 mL巴氏吸管/1000 μL移液枪、24孔细胞培养板、金属冰盒。

2.2  猪肠类器官构建

2.2.1 组织的处理

取材后的猪肠组织建议在 2 – 8 ℃条件下保存运输，快速转运至洁净实验室进行 猪肠类器官构建实验流程，组织拍照并登记详细信息。

2.2.1.1 组织的清洗

取样管消毒后，在超净台中将组织取出来，放入培养皿中，加入原代缓冲液 B，用3 mL巴氏吸管或1000 μL移液枪吹打清洗，重复清洗操作三次及以上。

2.2.1.2 组织的解离与消化                                                                                            

用眼科剪或手术刀片去除组织杂质，镊子转移至1.5 mL EP管中，原代缓冲液清洗三次后，刮除绒毛，用眼科剪进一步将组织机械解离成体积约为 3 mm3的组织块，转移至15 mL EP管中，加入5 mL原代组织消化液4℃震荡消化15-25 min。消化过程每10 min显微镜下观察组织消化情况，取少量消化液在显微镜下观察，隐窝组织消化程度见图一。

图一组织消化成较隐窝

2.2.1.3    组织的过滤

消化完成组织通过100 μm孔径的细胞筛网过滤，收集滤液，加入3倍体积的原代缓冲液B漂洗终止消化，300 g富集离心5 min后弃上清；若细胞沉淀含有红细胞，加入1-2 mL红细胞裂解液1-2 min后，稀释至10 mL，300 g富集离心5 min后弃上清。

2.2.1.4 类器官培养

观察离心收集的细胞沉淀体积量，添加25倍体积的基质胶重悬，形成3D培养空间结构，重悬过程中避免产生气泡。细胞沉淀体积量见图二，按照如图细胞沉淀量分别加入300 μL、250 μL、150 μL、100 μL基质胶。

图二 细胞沉淀体积量

24孔细胞培养板按照25 μL-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4 ℃条件下操作。细胞培养板放置37 ℃培养箱中10-15 min，待基质胶凝固后，每孔添加500-750 μL 猪肠类器官培养基A（提前37 ℃预热）进行培养。

3 类器官传代培养（以24孔板为例）

3.1 实验材料

传代缓冲液G（4 ℃）、类器官传代消化液D（室温或37 ℃）、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、 猪肠类器官培养基A（室温或37 ℃）、1.5 mL/15 mL离心管、24孔细胞培养板、冰盒。

3.2  类器官传代

选择合适的类器官进行传代，一般为生长一周左右，显微镜10X下可看到超过20个的类器官，或大小100-200㎛的类器官。

吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液G，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中，每6-8孔转移至一个离心管，4 ℃静置10-15 min。

3.2.1 类器官消化

根据类器官的生长情况来决定是否需要消化传代。离心后若管底沉淀少、未见细胞、基质胶未分层等情况，可再次重悬，提高离心力，再次离心。

当类器官数量不足或体积较小时，300 g离心5 min弃上清。

当类器官数量较多或体积较大时，300 g离心5 min弃上清，可选择消化液消化或机械消化。

消化液消化：加入1-2 mL类器官传代消化液D，将细胞沉淀吹散后，室温消化1 min，每隔一分钟吹打一次，显微镜下观察，直至消化至（图三A-B）状态时即可停止。添加3倍类器官消化液体积的传代缓冲液G终止消化，300 g离心5 min，弃上清。

图三 类器官传代消化程度图

3.2.2 传代类器官培养

观察离心收集的类器官沉淀体积量，若沉淀很少可预留1倍沉淀体积的上清液点胶，沉淀很多上清可吸净，添加25倍类器官沉淀体积的基质胶量重悬类器官。基质胶体积量可参考“类器官原代培养操作图二”。

24孔细胞培养板按照25 μL-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4 ℃条件下操作。细胞培养板放置37 ℃培养箱中10-15 min，待基质胶凝固后，每孔添加750 μL 猪肠类器官培养基A（提前37 ℃预热）进行培养。(换液每三天换两次液体)

4 类器官冻存（以24孔板为例）

4.1 实验材料

传代缓冲液G（4 ℃）、类器官冻存液F（4 ℃）、15 mL离心管、细胞冻存管、程序降温盒、移液枪。

4.2 类器官冻存

暂不使用的类器官应冻存，放于低温环境保存。

吸掉培养基，每孔添加等体积的传代缓冲液G，移液枪轻柔吹散基质胶，收集于15 mL离心管中，每6-8孔转移至一个离心管，4 ℃静置10-15 min。300 g离心5 min弃上清，每三个孔加入2 mL类器官冻存液F，轻柔吹打混匀，转至细胞冻存管中，每管1 mL。

做好标记信息，放入程序降温盒中，移至-80 ℃冰箱中，48 h后，放入液氮罐中保存。或放入4 ℃冰箱40 min后，放入-20 ℃冰箱中2 h，移至-80 ℃冰箱中，48 h后，放入液氮罐中保存。

5 类器官复苏培养（以24孔板为例）

5.1 实验材料

传代缓冲液G、 猪肠类器官培养基A、基质胶（提前24 h放入4 ℃冰箱融化）、24孔细胞培养板、冰盒、15mL离心管、水浴锅、3mL巴氏吸管/移液枪。

5.2 类器官复苏培养

从低温环境中取出冻存的类器官，快速置于37 ℃水浴锅中融解，水浴融解过程中，需轻轻摇动冻存管，以确保冻存液在短时间内完全融解。将解冻后的类器官快速转移至15 mL离心管，使用移液枪轻柔吹打6-8次，300 g 离心5 min弃上清；添加适量传代缓冲液G重悬，移入1.5 mL离心管300 g离心5 min，弃上清。

按每管冻存管添加100 μL基质胶重悬，24孔细胞培养板按照25 μL-30 μL/孔点胶，基质胶全程维持在0-4 ℃条件下操作。细胞培养板放置37 ℃培养箱中10-15 min，待基质胶凝固后，每孔添加500-750 μL 猪肠类器官培养基A（提前37 ℃预热）进行培养。

6 基质胶使用

在2–8 ℃环境条件下，基质胶过夜解冻。当使用基质胶时，请将其放在冰盒以防止过早凝固。基质胶在37 ℃下20分钟内形成凝胶。

6.1 基质胶特点：

Ø  4 ℃连续14天仍可保持较好的流动性

Ø  放入37 ℃培养箱中10-15 min即可凝固

Ø  培养过程中不易破损，去胶干净不粘培养板

运用范围:

FOR LABORATORY RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

上海睿远生物医药科技有限公司

官方网址：www.fulaibio.com

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电话：19946275258/18317065317